• ¿Qué es una secuencia?
• ¿Por qué comparar secuencias?
• Breve introducción acerca de cómo evolucionan las proteínas
• ¿Cómo comparar secuencias?
• ¿ADN (ARN) o proteínas? ¿Qué secuencias comparar?
• Comparación por identidades
• Comparación por parecidos
• Matrices de sustitución
• Comparación incluyendo inserciones y deleciones
• Alineamiento local versus alineamiento global
• Búsqueda de parecidos en las bases de datos
• Heurísticas de BLAST y FASTA
• Estimación de la probabilidad de que un determinado parecido entre secuencias se deba al azar: el e-value
• Filtros SEG, XNU, COILS y DUST
• Alineamientos múltiples

¿Qué es una secuencia?
es una serie de elementos encadenados uno detrás de otros, por eso hablamos de secuencias de nucleótidos y de secuencias de aminoácidos. A través de letras podemos identificar los distintos monómeros que conforman la macromolécula (ejemplo: A: adenina; T: timina; C: citosina; y G: guanina; ó A: alanina; D: aspártico; E: glutámico; etcétera).
 

¿Por qué comparar secuencias?
Para comprender la utilidad de la comparación de secuencias y de la búsqueda de homólogos (proteínas que tienen un origen evolutivo común), necesitamos tener algunos conceptos acerca de cómo evolucionan las proteínas.
 

Breve introducción acerca de cómo evolucionan las proteínas.
La idea generalmente aceptada es que a lo largo de la evolución unas especies van dando lugar a otras nuevas. Detrás de estas especiaciones está la variación genética de los organismos, con la evolución de los genomas, sus genes,  y de las proteínas codificadas por éstos.

Cuando observamos diferencias entre secuencias de proteínas que sabemos que tienen un origen evolutivo común, estas diferencias están hablándonos de las propiedades funcionales de las proteínas: algunas diferencias estarán allí porque la mutación no ha alterado la función, han sido más o menos neutrales; la observación de otras diferencias quizás tenga que ver con el hecho de que esas proteínas, aunque tengan un origen común, realicen funciones distintas. Y otras diferencias tendrán que ver con el modo de vida del organismo: por ejemplo, las bacterias que viven en fuentes termales a temperaturas muy altas tienen proteínas con una T  (temperatura) de desnaturalización también muy alta (gracias a la secuencia de aminoácidos). Por otra parte, el hecho de que determinadas posiciones de las secuencias permanezcan invariables, nos indica que éstas tienen una especial importancia para el mantenimiento de la estructura o la función de la proteína.

¿Cómo responde un organismo a una mutación? (dicho de otra forma: ¿cómo le afecta una mutación?): de distinta forma según las distintas situaciones. Por ejemplo, en cuanto a las mutaciones, éstas se tolerarán cuando no produzcan alteraciones en la estructura o en la función de la proteína. Sin embargo, en el caso de que se trate de un gen duplicado existe una mayor flexibilidad, la pérdida de función del nuevo gen no es dramática ya que existe otra copia. El barajado de dominios en unos casos producirá proteínas beneficiosas y en otros no. Según lo beneficiosos o perjudiciales que sean los cambios en las proteínas los organismos que los porten serán seleccionados positiva o negativamente, lo que determinará que los cambios pasen a generaciones venideras o, visto de otra forma, determinará que en el momento actual, en el que vivimos nosotros, observemos esos cambios: las secuencias que observamos ahora reflejan toda una historia evolutiva en la que las proteínas han ido divergiendo, adquiriendo nuevas funciones, adaptándose a nuevos entornos... y tenemos la oportunidad de desvelar algunos de esos secretos.
 

Las proteínas son cadenas polipeptídicas de aminoácidos ensamblados secuencialmente (de ahí el nombre de secuencia). La secuencia de una proteína determina qué estructura tridimensional tendrá ésta. El resultado de la adopción de una estructura tridimensional es que se forman superficies moleculares con distintas propiedades, quedando aminoácidos específicos en una orientación determinada, lo que permite a la proteína llevar a cabo su función.

Entonces, podemos decir que la comparación de secuencias es una forma de hacer arqueología, de descubrir qué partes de las secuencias son más importantes (están más conservadas), descubrir qué proteínas tienen un origen común (existen modelos estadísticos que nos ayudan a distinguir parecidos al azar de parecidos que reflejan un mismo origen evolutivo), la comparación de secuencias también nos puede servir para predecir la estructura de las proteínas (las proteínas homólogas tienen una misma arquitectura tridimensional), o también nos puede ayudar a predecir la función de las proteínas (aunque en este aspecto hay que ser cautelosos ya que a lo largo de la evolución proteínas con un origen común pueden terminar desarrollando distintas funciones, como veremos más adelante).
 

 

¿ADN (ARN) o proteínas? ¿Qué secuencias comparar? La elección de comparar secuencias de nucleótidos o de aminoácidos depende de la información que busquemos. Uno de los aspectos más importantes para decidir qué queremos comparar radica en que el parecido entre secuencias de nucleótidos con un origen común se pierde más rápidamente que el parecido en las secuencias de aminoácidos correspondientes: por una parte porque el alfabeto es más reducido (cuatro letras frente a veinte) y por otra porque la secuencia de nucleótidos puede cambiar sin que esto se refleje en la de aminoácidos (cambios sinónimos). La comparación de secuencias de nucleótidos es apropiada cuando: -queremos comparar secuencias muy parecidas, en las que quizás sólo hay diferencias en uno o dos nucleótidos (estudios filogenéticos de poblaciones, SNPs, etc). -por ejemplo, cuando queremos identificar genes: si comparamos zonas equivalentes del genoma de ratón y del genoma de humanos, vemos que las regiones exónicas están más conservadas que las intrónicas. -queremos comparar secuencias no codificantes. -etcétera. La comparación de secuencias de aminoácidos es apropiada cuando: -queremos buscar homólogos, ya sean más o menos cercanos o sean lejanos: no sólo el parecido en la secuencia aminoacídica se pierde más lentamente, sino que sabemos que algunos aminoácidos tienen propiedades más parecidas que otros, por lo que podemos darle más sentido a los cambios que observamos. -queremos identificar regiones importantes de las proteínas. -etcétera.

• Comparación por identidades: Podríamos simplemente desplazar una sobre otra y determinar cuál es la superposición (alineamiento) en la que el número de identidades es mayor:
 

TCAGACGATTG          (r=0) ATCGGAGCTG          TCAGACGATTG          (r=1)  ATCGGAGCTG          TCAGACGATTG          (r=0)   ATCGGAGCTG          TCAGACGATTG          (r=2)    ATCGGAGCTG ...      TCAGACGATTG          (r=4)   éste sería el mejor alineamiento         ATCGGAGCTG ...          TCAGACGATTG          (r=0)                    ATCGGAGCTG

Limitaciones de esta aproximación:
• sólo tiene en cuenta identidades, sin embargo sabemos que hay sustituciones (p.e. base púrica -> base púrica) que son más probables que otras (base púrica -> base pirimidínica).
• no tiene en cuenta la posible existencia de inserciones y deleciones.
• no tiene en cuenta la frecuencia de cada símbolo (si dos símbolos muy poco frecuentes coinciden, ha de tener más peso que si coinciden dos símbolos más abundantes).
• otras...

 
La representación mediante una matriz:
 

Matriz para encontrar el mejor alineamiento

Matriz dot-plot. Las diagonales representan zonas que alinean bien.

Una vez encontrado el punto de la matriz con una puntuación mayor, simplemente hay que recorrer la diagonal hacia atrás para obtener el mejor alineamiento.

• Incluyendo información de sustituciones para obtener el alineamiento que mejor refleje la historia evolutiva.
Lo que se hace no es asignar un "punto" por cada coincidencia de letras, sino que cada par de letras del alfabeto tiene un peso asociado, así, Leu e Ile (que son muy parecidos) tienen una puntuación positiva, mientras que Trp y Asp (muy distintos) tienen una puntuación negativa.

Matrices de sustitución. ¿cómo determinar si una sustitución determinada (p.e. Cys -> Met) ha de tener una puntuación positiva o negativa, es decir, si es un cambio sin mucha trascendencia o por el contrario, las características de ambos residuos son muy distintas. Las más conocidas son PAM y BLOSUM. Básicamente se construyen a partir de alineamientos; a partir de ellos calculan la frecuencia con que cada par de residuos aparece sustituido (en una misma posición del alineamiento), y lo comparan con la frecuencia que por azar debería observarse esa sustitución (el producto de las frecuencias con que aparecen en las proteínas cada uno de los aminoácidos). Es el cálculo de log-odds. Por ejemplo, en BLOSUM62 vemos que D -> E (aspártico -> glutámico, ambos ácidos) = 2, mientras que D -> L (aspártico -> leucina, ácido a hidrofóbico) = -4. Esto nos indica que en los alineamientos utilizados para construir la matriz BLOSUM62, se observó con mayor frecuencia de la esperada el cambio D->E, no así el cambio D->L. Algunos de los residuos cuya conservación parece más importante son el W (11), la C (9), la H (8), la P (7), etc. (diagonales) Las distintas matrices BLOSUM como blosum45, blosum62 o blosum80, se construyen a partir de alineamientos en los que las secuencias se parecen al menos un 45%, un 62% o un 82%. La más usada es la blosum62, aunque en teoría la blosum80 proporcionaría mejores alineamientos cuando trabajásemos con secuencias cercanas, y la blosum45 con secuencias más lejanas.

El cálculo del mejor alineamiento se hace de forma similar al del caso de la comparación por identidades.
AGLS
ATLT   Según Blosum62: 4+(-2)+4+1  =  7.
AGLS
 ATLT  Según Blosum62: 0+(-1)+(-2) = -3.
...
Pero aún no sabemos qué hacer con las inserciones y deleciones....

 
 
 
• Incluyendo información de inserciones y deleciones:
Cuando queremos comparar secuencias incluyendo inserciones y deleciones, el problema se complica sustancialmente. Por una parte, el número posible de alineamientos es enorme, y comprobar la puntuación para cada uno de ellos llevaría muchísimo tiempo. Por otra parte, ¿qué puntuación deberemos asignar a la inclusión de un "gap"? ¿menos 5? ¿menos 10?.
La primera parte del problema se solucionó cuando Needleman & Wunsch (y posteriormente Smith & Waterman) propusieron un algoritmo de programación dinámica que permitía encontrar el alineamiento con una mayor puntuación de forma rápida. Este modo de programar se puede aplicar cuando: 1) el estado inicial contiene soluciones triviales a sub-problemas; 2) cada solución parcial en una etapa posterior puede ser calculada recurriendo a un número fijo de soluciones parciales de etapas anteriores; y 3) el estado final contiene la solucion global. El alineamiento de secuencias cumple estos requisitos.
La segunda parte no está del todo resuelta, aunque existen algunos modelos más o menos satisfactorios. Lo más sencillo es asignar una puntuación negativa a cada gap (p.e. -5), pero este modelo penaliza del mismo modo cinco deleciones puntuales en cinco zonas distintas de la proteína que una sola deleción de tamaño cinco, cuando ésta debería ser más probable. Para evitar eso, se utiliza un modelo de inserciones/deleciones en el que la apertura de un gap en el alineamiento se penaliza más (p.e. con -10) que la extensión (p.e. -1).
Caso 1:
ATGA-GATG-AT-GATAACG-ATG
ATGATGATGTATAGATAACGAATG

Caso 2:
ATGAGATG----ATGATAACGATG
ATGATGATGTATAGATAACGAATG

Penalizando de igual modo apertura y extensión de gaps (huecos) en ambos casos la penalización tendría el mismo valor.
Si penalizamos más fuertemente la apertura que la extensión de un gap, el caso 2 será más probable evolutivamente (tendrá una puntuación más favorable, menos penalización).


 

Para elegir en cada casilla de la matriz cuál es la mejor opción, se elije el máximo de:

Esta forma de "rellenar" la matriz garantiza que obtenemos el mejor alineamiento, sin necesidad de explorar todas las posibilidades.
 

Un ejemplo: las secuencias:
HEAGAWGHEE
y
PAWHEAE


 
• Alineamiento local versus alineamiento global:

Existen dos formas de alinear dos secuencias: intentando encontrar los dos fragmentos de ambas secuencias que tienen un alineamiento con una puntuación máxima (local) o aquél alineamiento de las secuencias completas también con una puntuación máxima (global).
El alineamiento local es adecuado cuando las proteínas no se parecen a lo largo de toda su secuencia, por ejemplo si una tiene un dominio A y otro B y la otra tiene un dominio A y otro C (B y C no son homólogos y no tendría sentido intentar alinearlos). El rellenado de la matriz es similar al visto anteriormente, pero cuando una puntuación sale negativa, se asigna el valor 0 a la casilla en cuestión.


 
 

Búsquedas de parecidos en las bases de datos.

Actualmente las bases de datos contienen un gran número de secuencias, y crecen de forma exponencial. Por ejemplo en Genbank ya hay: más de 28.000 millones de pares de bases (nucleótidos), correspondientes a más de 22.000 millones de secuencias. Por otra parte conocemos más de un millón de secuencias de proteínas.

En este contexto, aplicar algoritmos como el de Smith & Waterman no es factible, ya que tardaría demasiado tiempo, a no ser que dispusiéramos de máquinas especiales que trabajasen en paralelo. Por eso existen métodos como BLAST y FASTA que aplican heurísticas (o "truquillos") para reducir el tiempo de búsqueda. Estos "truquillos" no garantizan el resultado óptimo pero casi siempre funcionan, y la ganancia en tiempo hace que compense usarlos.
 

Heurísticas de BLAST y FASTA.
Estos métodos son muy rápidos. Básicamente utilizan los siguientes "truquillos":

• tablas de dispersión: en lugar de representar una secuencia como tal, utilizan una tabla tal que:

 
posición   : 12345678901
secuencia X: TCAGACGATTG

Tabla de disperisón de X:
A   3, 5, 8
C   2, 6
G   4, 7, 11
T   1, 9, 10


Si hacemos lo mismo con una secuencia Y, ahora cuando comparemos X e Y sólo tendremos que recorrer una vez la secuenca Y, y por cada elemento de ella, tantas posiciones como se indique en la tabla de dispersión de X. Dicho de otro modo, si Y empieza por una C, no tenemos que mirar una a una todas las posiciones de X para ver donde hay una C, ya que ya hemos construido una tabla y podemos ver directamente, en la fila de las C, que en X hay una C en las posiciones 2 y 6.
 

• k-tuplas: en lugar de representar una secuencia de proteínas a partir de los 20 aminoácidos posibles, la representan mediante palabras de mayor tamaño, por ejemplo k=2, con lo que el alfabeto aumenta a 400 (20*20). De este modo, la tabla de dispersión tiene más filas (400), pero el número de columnas por fila disminuye, y por tanto el número de coincidencias entre X e Y también disminuye.

• Búsqueda en las diagonales en las que más probablemente se encuentra el mejor alineamiento: la idea es no consultar toda la matriz para buscar el mejor alineamiento sino fijarnos sólo en las diagonales que, por ejemplo, haya más coincidencias.






La mejor diagonal (la -1) (en este ejemplo no se tiene en cuenta la influencia de los gaps) es la correspondiente a:
 

  GTCCGACTAGTG
   || ||   |
 CATCGGAGCTG


La búsqueda del mejor alineamiento la haríamos quizás en las diagonales -1, 2 y 4, olvidándonos del resto. No garantiza el resultado óptimo pero casi siempre funciona, y es mucho más rápido.

Gracias a estos truquillos, el tiempo de comparación de O(NxM) se reduce a O(N+M).

En FASTA (Lipman & Pearson, 1985) se obtienen las mejores diagonales y a partir de ellas se calculan los mejores alineamientos. Posteriormente se intentan unir las diagonales entre sí incluyendo gaps.

El artículo original de BLAST (Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ, 1990) es el más citado de la década de los 90. La principal diferencia con FASTA es el modo en que busca las diagonales. En el caso de FASTA, si usamos una tabla de dispersión con k-tuplas de tamaño 4, sólo se tienen en cuenta las coincidencias entre las secuencias X e Y (p.e, la palabra AAAA en X sólo se corresponderá con AAAA en Y, mientras que si en Y hay AAAT, no se registrará el parecido). Sin embargo en BLAST, cuando se construye la tabla de dispersión de la proteína problema se pre-calculan los parecidos entre las distintas palabras. Por ejemplo: si la proteína problema (X) empieza por CTDCGRSGLI...) y usamos  tuplas de k=4, la primera palabra de X será CTDC, y BLAST calculará qué otras palabras (según la matriz de sustitución) tienen  una puntuación positiva (por ejemplo CSDC). De este modo se gana en sensibilidad, aunque aumenta el espacio de búsqueda. Para reducir un poco este espacio, sólo se apuntan aquellos parecidos entre palabras suficientemente altos (esto viene dado por un parámetro T de BLAST).

Estimación de la probabilidad de que un determinado parecido entre secuencias se deba al azar: el e-value
Uno de los problemas más importantes una vez hemos encontrado parecidos en las bases de datos es saber si son significativos o si podrían deberse al azar y por tanto no reflejan una relación de homología. En el caso de parecidos muy claros, la respuesta es evidente, pero hay muchos otros parecidos que no lo es, y para resolver este problema se  han desarrollado diversos modelos estadísticos. Básicamente lo que se hace es calcular la probabilidad de que un alineamiento entre secuencias no relacionadas (por azar) alcance una puntuación (score) determinado; en esto influyen diversos aspectos:

• la matriz de sustitución empleada: hay matrices que tienden a dar puntuaciones más positivas que otras.
• la composición de aminoácidos de las secuencias alineadas: por ejemplo, si ambas secuencias tienen muchas Cys y éstas en la matriz de sustitución suelen tener puntuaciones más positivas que otros aminoácidos, una puntuación alta de tal alineamiento será menos significativa.
• la longitud de las secuencias alineadas (o el tamaño de la base de datos -ver más abajo-): cuanto mayores sean las secuencias, mayor será la probabilidad de que por azar alcancen un determinado score.

 

 
 

A partir de un modelo en el que estudiaron qué scores alcanzaban los alineamientos de secuencias generadas al azar (según las frecuencias observadas de aminoácidos), Karlin & Altschul desarrollaron la siguiente fórmula para el cálculo del e-value:



El e-value (E) de un determinado score indica cuántos alineamientos esperamos que por azar alcancen un score igual o mayor dadas los tres factores antes mencionados (no confundir con el p-value, que indica la probabilidad de que un score se haya alcanzado por azar al menos en una ocasión; e-value y p-value se relacionan mediante la siguiente fórmula:



y tienen un valor prácticamente idéntico en la escala que va de 0 a 0.01).

Cuando tratamos con una base de datos más importante que la longitud de las secuencias es el tamaño de la base de datos: cuanto mayor sea ésta, con mayor probabilidad aparecerán alineamientos que por azar alcancen un determinado score. En la fórmula del e-value K y lambda son dos parámetros que se determinan empíricamente, M y N son las longitudes de las secuencias y S es el score (la puntuación del alineamiento). Pues bien, en el caso del cálculo de e-values en el contexto de la búsqueda en bases de datos M se toma como el tamaño de la base de datos (número total de aminoácidos o nucleótidos; si bien se aplica una corrección -edge effect o efecto de los extremos- que se explica en el enlace: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/tutorial/Altschul-1.html).

En la práctica tenemos que tener en cuenta lo siguiente: el e-value depende del tamaño de la base de datos (si una DB es 10 veces menor que otra, el e-value será 10 veces menor, también). En general con bases de datos grandes, nos podemos fiar de e-values menores de 1e-05, y en el rango 1e-05 a 0.1 casi siempre nos podemos fiar; por encima de 0.1 ya es más arriesgado. Sin embargo, lo mejor siempre es utilizar el criterio propio, mirar los alineamientos a ojo, hacer alineamientos múltiples, búsquedas con PSI-BLAST, etcétera, como veremos más adelante.

Para saber más acerca de Alignment Scoring Statistics:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/tutorial/Altschul-1.html
http://blast.wustl.edu/doc/infotheory.html

Filtros SEG, XNU, COILS y DUST.

Hay algunos casos en que las secuencias, por tener características especiales, pueden alcanzar fácilmente puntuaciones altas en sus alineamientos aún no estando relacionadas:

• secuencias de baja complejidad (filtro SEG para aminoácidos y filtro DUST para nucleótidos): por ejemplo secuencias con muchas alaninas o prolinas repetidas. Éstas secuencias darán fácilmente alineamientos de alta puntuación con otras secuencias que también tengan por ejemplo zonas ricas en prolinas, aunque no estén relacionadas. Además, casi cualquier forma de alinearlas dará puntuaciones elevadas. Por ejemplo:

 

 

secuencia 1: RCTAASAAAAAARAA
secuencia 2: GYAAAAALAAAAAA

Alineamientos con buenas puntuaciones:

RCTAASAAAAAARAA
 GYAAAAALAAAAAA

RCTAASAAAAAARAA
  GYAAAAALAAAAAA

RCTAASAAAAAARAA
   GYAAAAALAAAAAA  etcétera


El filtro SEG enmascara estas regiones sustituyendo los códigos de los aminoácidos por X.
 

• secuencias repetitivas (filtro XNU): se aplica a secuencias con cortas repeticiones.
• secuencias de coiled-coils (filtro COILS): se aplica a secuencias de coiled-coils. Éstas, al tener una periodicidad (suelen tener una Leu o una Ile cada 7 residuos) pueden dar buenas puntuaciones con otras proteínas que también adopten coiled-coils, sin que por ello compartan un origen evolutivo común (sean homólogas).

¿Cuándo aplicar los filtrados? Normalmente lo mejor es probar a realizar la búsqueda (p.e. BLAST) con y sin filtrado, inspeccionar los resultados y determinar si el filtrado en ese caso nos permite eliminar parecidos espúreos (al azar). Si no aporta nada, mejor no utilizarlo porque estamos perdiendo información de secuencia que podría ayudarnos a encontrar homólogos más lejanos.

Alineamientos múltiples

Por alineamiento múltiple nos referimos al alineamiento de más de dos secuencias. Los alineamientos múltiples de secuencias son el pilar central de multitud de métodos bioinformáticos.
Como hemos visto, el alineamiento mediante programación dinámica de dos secuencias tiene una complejidad O(NxM). Pues bien, si queremos alinear tres secuencias, la complejidad sería de O(NxMxL). O dicho de otra forma: si alinear dos secuencias de 300 residuos tarda un segundo, alinear tres secuencias tardará 300 segundos. Y alinear 10 secuencias tardará 300⁸ segundos (más que la edad del universo).

En resumidas cuentas, no podemos resolver el problema del mismo modo que para un par de secuencias.

Una aproximación a la solución de este problema la propusieron Carrillo & Lipman en 1988, y posteriormente fue aplicada para el desarrollo del programa MSA (Lipman, Altschul & Kececioglu, 1989). La idea es calcular el parecido entre todos los pares de secuencias, de modo que obtengamos una medida de su distancia evolutiva. Se toman las dos secuencias más cercanas y se alinean entre sí. A partir de este momento ambas secuencias se tratan como una sola. Se vuelven a alinear las dos más cercanas.... y así sucesivamente hasta que no quedan más.

ClustalW (Thompson, Higgins & Gibson, 1994) es el programa más comúnmente utilizado y sigue un enfoque similar: a partir de la matriz de distancias entre las secuencias se construye una especie de árbol guía y se van alineando las secuencias entre sí de acuerdo a este árbol.

El resultado de estos programas no tiene por qué ser el óptimo, pero normalmente funcionan bien, aunque a veces hay que corregir algunas zonas del alineamiento a mano, utilizando programas como SeaView.

Finalmente, decir que recientemente se ha desarrollado un nuevo método de alineamiento llamado T-coffee (Notredame, Higgins & Heringa, 2000) que resuelve muchos de los problemas de ClustalW, aunque requiere un mayor tiempo de computación.
 

¿Cuál es la utilidad de los alineamientos múltiples? lo veremos en la siguiente clase: Análisis de secuencias: motivos y perfiles.